Chapitre 1 Moyens et objectifs de l'anatomie pathologique en médecine
Auteur : Jérôme Cros
Plan du chapitre
• Historique
• Place de l'anatomie pathologique en médecine
• Place de l'anatomie pathologique dans la recherche
• Connaître la place de l'anatomie pathologique dans la démarche médicale.
• Connaître et savoir donner des exemples des différents types de prélèvements cytologiques.
• Connaître et savoir donner des exemples des différents types de prélèvements tissulaires.
• Connaître les différentes étapes techniques qui vont permettre l'analyse microscopique d'un prélèvement cellulaire.
• Connaître les différentes étapes techniques qui vont permettre l'analyse microscopique d'un prélèvement tissulaire.
• Connaître les principes de la fixation cellulaire/tissulaire.
• Connaître les principes (apports et limites) d'un examen cytopathologique.
• Connaître les principes (apports et limites) d'un examen extemporané.
Historique
Malgré des progrès isolés et significatifs depuis la Renaissance, la médecine restait au xviiie siècle en France ainsi que dans de nombreux autres pays européens, tributaire de croyances périmées et de systèmes sociaux peu propices au progrès des connaissances médicales. La médecine, jadis réservée aux clercs, continuait à être enseignée à l'université alors que la chirurgie en avait été écartée pendant des siècles par une faculté de médecine intransigeante.
1799 : publication du Traité des membranes par Bichat
Ce traité qui constitua l'ouvrage fondamental de l'anatomopathologie initia une nouvelle façon de voir l'anatomie. En effet, à côté d'une vision montrant des organes voisins les uns des autres, il proposait une conception de l'homme constitué d'enveloppes successives autour des différents organes. Ce modèle se révéla étonnamment utile et permit de prédire de façon satisfaisante l'évolution d'un certain nombre de maladies, telles que des pathologies couramment observées à l'époque, comme la tuberculose. On observait alors très fréquemment des lésions des séreuses pleurales, péritonéales et péricardiques.
1819 : publication du Traité de l'auscultation médiate par Laennec
Il s'agissait d'une auscultation au moyen d'un cylindre, précurseur du stéthoscope.
Ces nouvelles méthodes donnèrent des résultats objectifs et fiables pour l'examen des organes internes. Cet ouvrage consacré en principe à la présentation et à la promotion de ce nouvel outil diagnostique comportait une partie très importante dédiée à l'examen post-mortem et à la pathologie macroscopique des tissus. Le lien entre l'auscultation et la percussion d'une part et les autopsies d'autre part était très étroit. En effet, ces nouvelles méthodes d'examen ne trouvaient leur valeur que dans une corrélation étroite avec les autopsies. Tout ceci aboutit vers les années 1830 à la constitution d'un ensemble de connaissances qui se trouva alors brutalement confronté à un nouvel instrument : le microscope.
Place de l'anatomie pathologique en médecine
Démarche diagnostique
L'anatomie et cytologie pathologiques (ou pathologie) est une discipline médicale qui étudie les lésions provoquées par les maladies, ou associées à celles-ci, sur les organes, tissus ou cellules, en utilisant des techniques permettant l'examen morphologique macroscopique (les lésions visibles à l'œil nu) d'une part et l'examen microscopique et moléculaire d'autre part.
Les lésions sont des altérations morphologiques des organes, décelables par tout moyen d'observation. Celles-ci sont des signes de maladies, au même titre que les symptômes cliniques. Elles peuvent être le résultat direct de l'agression qui a déclenché la maladie (ex. : hépatite virale détruisant les hépatocytes), ou celui des réactions apparues au cours du déroulement du processus morbide (ex. : cirrhose hépatique compliquant une hépatite virale au long cours). La lésion élémentaire correspond à l'altération morphologique d'une structure analysée isolément. L'association de différentes lésions élémentaires constitue un ensemble lésionnel.
Il n'y a pas forcément de corrélation étroite entre l'importance d'une lésion et son expression clinique ou biologique. Les causes des lésions sont variées : anomalies génétiques constitutionnelles ou acquises, agents infectieux (bactéries, virus, parasites, champignons, prions), agents chimiques (toxiques, caustiques, médicaments), agents physiques (agression thermique, radiations, modifications de pression atmosphérique, traumatismes), déséquilibres circulatoires, nutritionnels ou hormonaux, troubles immunitaires innés ou acquis et sénescence.
La démarche de l'anatomie pathologique est fondée sur une analyse sémiologique qui compare les tissus normaux et les tissus pathologiques (comparaison macroscopique, microscopique et moléculaire). Les lésions sont confrontées aux données cliniques, biologiques et d'imagerie : c'est la corrélation anatomoclinique, qui est indispensable pour permettre une interprétation synthétique qui aboutit à un diagnostic (certain, probable ou incertain).
Buts de l'anatomie pathologique dans la pratique médicale
Le rôle du pathologiste est de contribuer à :
• élaborer le diagnostic par la démarche anatomoclinique : les lésions élémentaires sont analysées et décrites dans un compte-rendu, puis groupées en grands ensembles lésionnels et intégrées avec des renseignements cliniques et si nécessaire des données moléculaires pour, en conclusion du compte-rendu, affirmer un diagnostic ou proposer une hypothèse diagnostique ;
• préciser le pronostic en apportant des éléments utiles, en particulier dans le domaine de la pathologie tumorale ;
• prédire l'efficacité des thérapeutiques grâce à certains biomarqueurs dont l'expression (ou l'absence) est associée à la réponse au traitement ;
• évaluer l'effet des thérapeutiques : les examens anatomocytopathologiques sont renouvelés au cours d'un traitement afin de juger de la disparition, de la persistance ou de l'aggravation des lésions.
Différents types de prélèvements
Prélèvements cytologiques
Les cellules isolées, ou les petits amas cellulaires, peuvent être obtenus de diverses façons :
• recueil des liquides spontanément émis (urine, expectoration, fistule, drain) ;
• raclage, brossage, écouvillonnage, aspiration de cellules desquamant spontanément (col utérin, bulle cutanéo-muqueuse, bronches, voies biliaires, aspiration après lavage bronchoalvéolaire) ;
• ponction à l'aiguille d'un liquide (épanchement de séreuse ou articulaire, liquide céphalo-rachidien, kyste, collection) avec ou sans contrôle écho-ou scannographique ;
• ponction à l'aiguille d'un organe ou d'une tumeur (ganglion, nodule thyroïdien ou mammaire) avec ou sans contrôle échographique ou scannographique ;
• apposition d'un tissu (pièce opératoire, biopsie) sur une lame de verre.
Prélèvements tissulaires
Il existe différents moyens d'obtenir ces prélèvements : la biopsie, les pièces opératoires et l'autopsie.
Biopsie
La biopsie consiste à prélever un fragment de tissu sur un être vivant en vue d'un examen anatomopathologique. Par extension, ce terme peut désigner le fragment tissulaire.
La biopsie peut être effectuée selon plusieurs modalités :
• par ponction à l'aide d'une aiguille coupante ou d'un trocart (foie, rein, os, etc.) : on obtient des cylindres de tissu de quelques millimètres à quelques centimètres de long (figure 01.01). Les ponctions sont effectuées « à l'aveugle » lorsque l'ensemble de l'organe est malade, ou sous repérage (échographie, scanner) lorsque la ponction doit être dirigée sur une lésion focale visible en imagerie ;
• par biopsie chirurgicale après anesthésie locale ou générale et sous contrôle de la vue : biopsie partielle, ou biopsie exérèse enlevant la totalité de la lésion ;
• au cours d'une (écho)endoscopie (pince montée sur l'(écho)endoscope) : il s'agit généralement de très petits fragments de 0,5 mm à 2 mm (figure 01.02).
Les critères de qualité des biopsies reposent sur :
1. leur taille (ex. : pour la recherche d'une artérite à cellules géantes où les lésions sont segmentaires, une biopsie d'artère temporale représentative doit mesurer au moins 1,5 cm de long) ;
2. leur nombre : plus elles sont nombreuses, plus on a de chance de trouver du tissu lésionnel, de rendre compte de son hétérogénéité et d'observer une lésion focale mais importante pour le diagnostic ;
3. le choix de la zone biopsiée : éviter les zones nécrotiques ou hémorragiques ; sur la peau ou une muqueuse, éviter les prélèvements trop superficiels ; biopsier le ganglion ayant déjà fait l'objet d'une ponction cytologique antérieure révélant des cellules anormales ;
4. la bonne préservation des tissus : ne pas étirer ou écraser les fragments, éviter le bistouri électrique « grillant » les tissus ;
5. le repérage topographique en cas de biopsies multiples (flacons différents répertoriés).
Pièces opératoires
Les pièces opératoires : exérèse partielle ou complète d'un ou de plusieurs organes, séparés ou en monobloc (figure 01.03).
Autopsie
L'autopsie (ou nécropsie) correspond à un examen anatomopathologique pratiqué sur un cadavre.
Les autopsies médico-légales sont pratiquées par les médecins légistes sur ordre de la justice (réquisition du procureur, ou ordonnance d'un juge d'instruction) dans tous les cas de mort suspecte, notamment lorsqu'il n'y a pas eu de délivrance de permis d'inhumer.
Les autopsies médicales et à but scientifique sont pratiquées par les médecins anatomopathologistes des hôpitaux, généralement à la demande des médecins qui ont soigné le patient pendant son séjour à l'hôpital dans le but de comprendre la cause du décès, éventuellement à la demande d'un médecin traitant pour un patient décédé à son domicile. Ce type d'autopsie ne peut être réalisée qu'après la vérification de l'absence d'opposition du défunt à des prélèvements post-mortem par une interrogation du Registre national des refus, tenu par l'Agence de Biomédecine ou avec une autorisation écrite des parents pour les enfants.
Techniques d'étude morphologique des prélèvements cellulaires et tissulaires
La qualité des prélèvements conditionne la qualité de l'étude anatomopathologique. Les médecins préleveur et prescripteur ont une responsabilité dans l'acte anatomopathologique en s'assurant de la bonne réalisation technique du prélèvement et de son acheminement dans de bonnes conditions au laboratoire (dans des délais brefs, en respectant les règles de fixation, accompagné d'une demande d'examen correctement renseignée).
Enregistrement
Lorsqu'un prélèvement parvient au laboratoire, il est enregistré et reçoit un numéro d'identification unique. Celui-ci sera retranscrit sur les blocs et les lames, qui seront examinées au microscope après le traitement technique du prélèvement. Chaque prélèvement doit être accompagné d'une fiche de renseignements remplie par le médecin prescripteur qui doit mentionner :
1. l'identité du patient : nom, prénom(s), date de naissance, sexe ;
2. le siège anatomique précis (sans oublier la latéralité pour les organes pairs) ;
3. la date (jour et heure) et la nature du prélèvement (type de prélèvement cytologique, biopsie ou exérèse) et son conditionnement (non fixé ou dans un liquide fixateur) ;
4. les circonstances cliniques et paracliniques qui ont motivé le prélèvement : données pertinentes connues de biologie et imagerie (en particulier indispensable pour les tumeurs osseuses), aspect per endoscopique ou per opératoire (un compte-rendu endoscopique ou opératoire peut être utilement joint) ;
5. éventuellement les hypothèses diagnostiques ;
6. les antécédents pathologiques du patient, en particulier, dans la mesure du possible, les antécédents d'examens anatomopathologiques effectués dans un autre laboratoire et la nature de ses traitements ;
7. les nom et coordonnées du médecin prescripteur et du préleveur, et éventuellement ceux des autres médecins correspondants ;
8. Si nécessaire : préciser le caractère urgent de l'examen ou indiquer d'éventuelles recherches particulières à effectuer.
Techniques d'étude des cellules
Étalement des cellules sur des lames de verre
L'étalement est fait par le préleveur lors des cytoponctions d'organes, des frottis, écouvillonnages, brossages ou appositions. Ce geste simple doit être bien maîtrisé pour éviter un écrasement des cellules, ou des amas de plusieurs couches peu interprétables (figure 01.04).
Cytocentrifugation sur lame de verre
Le liquide (naturel, ou d'épanchement, ou de lavage) est acheminé au laboratoire où il est centrifugé sur une lame de verre, sous forme de pastille ou « spot » (figure 01.05).
Fixation des étalements
Elle se fait soit par simple séchage à l'air pour la coloration de May-Grünwald-Giemsa (figure 01.06), soit par immersion dans l'alcool-éther ou par application d'un aérosol de laque fixante pour la coloration de Papanicolaou (frottis cervico-utérins notamment, figure 01.07).
Afin d'éviter l'altération des cellules par autolyse, la fixation, la cytocentrifugation et la coloration doivent être effectuées rapidement après l'obtention du prélèvement :
• fixation des frottis cervico-utérins étalés sur lames par le médecin préleveur ;
• acheminement rapide d'un liquide à l'état frais au laboratoire ;
• et coloration au MGG sans délai excessif de lames d'étalement séchées à l'air.
En cas de besoin (par exemple, recueil d'un liquide en dehors des heures d'ouverture d'un laboratoire) un liquide peut être provisoirement stocké dans un réfrigérateur à + 4 °C.
Étalement des cellules en monocouche
Cette technique consiste à recueillir les cellules par ponction (séreuse, organe plein…) ou par frottis (col utérin) et à les transmettre au laboratoire dans un liquide conservateur. Les cellules présentes dans le flacon de fixateur sont ensuite remises en suspension et éventuellement soumises à une dispersion par gradient de densité, concentrées (par filtration et/ou centrifugation) puis transférées en couche mince sur une lame et sur une pastille de taille déterminée.
Réalisation d'un culot de centrifugation
L'analyse des prélèvements cytologiques peut également se faire après fixation et inclusion en paraffine d'un culot de centrifugation, qui est alors pris en charge de la même façon qu'un prélèvement tissulaire. Cette approche permet de réaliser un complément d'analyse en immunohistochimie ou en biologie moléculaire selon le même protocole technique que celui utilisé pour les tissus. Elle permet parfois sur un petit fragment d'apprécier l'architecture du tissu et le rapport entre les cellules. La quantité de cellules étant également plus importante, les examens de biologie moléculaire sont classiquement plus rentables que sur une cytologie simple.
Avantages et limites des analyses cytopathologiques
La technique de prise en charge d'un prélèvement cytologique étant rapide (environ une heure), un résultat urgent peut être donné au médecin prescripteur de l'examen le jour même du prélèvement. Des colorations spéciales et des réactions immunocytochimiques peuvent également être effectuées, à condition de disposer du nombre de lames nécessaires (d'où l'importance des renseignements cliniques fournis à la réception du prélèvement).
Un examen cytopathologique fournit des renseignements parfois partiels. Par exemple, les anomalies cytoplasmiques et nucléaires observées dans des cellules cancéreuses peuvent être difficiles à distinguer de modifications cellulaires induites par des phénomènes inflammatoires ou régénératifs. En outre, lors de l'étude de cellules isolées, des critères importants du diagnostic d'un cancer tels que l'architecture du tissu néoplasique et ses relations avec le tissu sain ne sont pas analysables. L'examen cytopathologique est le plus souvent un examen de dépistage ou d'orientation diagnostique. Un contrôle par biopsie peut être nécessaire avant toute thérapeutique.
Techniques d'étude des tissus
La technique de base comporte plusieurs étapes : la fixation, l'inclusion en paraffine, la confection de coupes et leur coloration. Avant la fixation, il est possible d'effectuer sur le tissu non fixé des appositions sur lames pour une étude cytopathologique, et des prélèvements pour des techniques particulières :
• la congélation ;
• l'examen histologique extemporané ;
• la fixation adaptée à la microscopie électronique ;
• la mise en culture pour étude microbiologique, cytogénétique, ou en suspension cellulaire pour étude par cytométrie en flux.
En ce qui concerne les pièces opératoires, une étape d'analyse macroscopique est indispensable, avant (idéalement) ou après la fixation de la pièce.
Étude macroscopique
L'examen macroscopique détaillé est une partie essentielle de l'étude d'une pièce opératoire : la pièce est examinée, mesurée, pesée, palpée puis disséquée (figure 01.08). Chaque lésion est repérée sur un schéma et éventuellement photographiée. Ces constatations sont confrontées aux documents cliniques et/ou radiologiques, ce qui souligne l'importance des renseignements écrits fournis par le médecin clinicien. En cas de pièces opératoires complexes (exérèse monobloc de plusieurs organes, ou pièce de résection selon une méthode non conventionnelle), le chirurgien devra adresser la pièce avec des indications de repérage topographique. Il peut être utile de marquer les berges d'une pièce de résection de tumeur avec une encre indélébile : ceci ne nuit pas à l'étude histologique et permet d'apprécier exactement la distance entre la tumeur et la limite chirurgicale de la pièce (figure 01.09).
L'examen macroscopique est fondamental : il donne des indications pour le pronostic de la maladie (notamment la taille et la localisation d'un cancer) et il permet de sélectionner les territoires à prélever pour l'étude microscopique : zones lésées, zones d'aspect macroscopique sain et limites d'exérèse.
Après le choix des prélèvements destinés à l'analyse microscopique, les restes de la pièce opératoire sont conservés pendant quelques jours ou semaines afin de pouvoir en cas de nécessité effectuer des prélèvements complémentaires.
Fixation
La fixation est indispensable pour conserver la morphologie cellulaire, elle doit être immédiate ou au moins très rapidement débutée après l'obtention du prélèvement. Toute fixation défectueuse rend l'étude histopathologique et moléculaire difficile, voire impossible (dessiccation et/ou autolyse du tissu).
Si le laboratoire est situé à proximité immédiate du lieu de prélèvement, celui-ci peut être acheminé rapidement (moins d'une heure) et confié à l'anatomopathologiste qui choisira les conditions de fixation les plus adaptées. Sinon, la fixation doit être effectuée par le médecin préleveur.
Trois précautions doivent être prises pour une fixation de bonne qualité :
1. le volume du fixateur doit représenter environ 10 fois le volume de la pièce ;
2. le récipient doit être de taille suffisamment grande pour prévenir les déformations des pièces opératoires volumineuses ;
3. avant fixation, les organes creux (tube digestif, vésicule biliaire, utérus) doivent être ouverts et si nécessaire lavés de leur contenu afin de prévenir l'autolyse des muqueuses ; les organes pleins volumineux (foie, rate) doivent être coupés en tranches pour faciliter la pénétration rapide et homogène du fixateur, les poumons peuvent être fixés par insufflation d'une solution de formol dans les bronches ou coupés en tranches. Seuls les cerveaux de nécropsies seront plongés dans une solution de formol sans être tranchés en raison de la fragilité de la substance cérébrale.
La durée de la fixation dépend de la taille du prélèvement : au minimum environ 6 heures pour une biopsie et 24 heures pour une pièce opératoire, et de préférence moins de 48 h afin de limiter la dégradation des acides nucléiques.
Nature du fixateur : le fixateur le plus habituellement utilisé est une solution aqueuse de formol à 4 % tamponné. Il s'agit d'un produit toxique (allergisant, cancérigène) qui nécessite des mesures de protection lors de son utilisation : port de gants, lunettes, surblouses par les personnels médicaux et paramédicaux, et systèmes d'aspiration des vapeurs dans les laboratoires.
Cas particuliers des tissus calcifiés : les prélèvements calcifiés (os, certaines tumeurs) doivent être sciés, puis fixés, puis plongés dans une solution décalcifiante avant d'être inclus dans la paraffine, ce qui rallonge la durée de la technique.
Imprégnation et inclusion
Les prélèvements ayant achevé leur fixation sont déposés dans des cassettes en plastique, directement s'il s'agit de biopsies ou, s'il s'agit de pièces opératoires, après l'étape d'examen macroscopique au cours de laquelle sont prélevés des fragments de petite taille (en moyenne 2 cm × 1,5 cm sur 0,3 cm d'épaisseur). Puis les tissus contenus dans les cassettes sont déshydratés par passage dans des alcools, l'alcool est éliminé par des solvants (xylène), puis la paraffine liquide à 56 °C imprègne les tissus et est refroidie. Ces étapes sont automatisées dans des appareils à imprégnation/inclusion. L'étape finale de l'inclusion est parfois manuelle et consiste à réorienter convenablement le fragment tissulaire dans le sens de la coupe dans un moule de paraffine (figure 01.10).
Coupes et colorations
Le bloc solide de paraffine contenant le tissu est coupé grâce à un microtome, les coupes de 3 à 5 microns d'épaisseur sont étalées sur des lames (figure 01.11). Après dissolution de la paraffine, puis réhydratation, le tissu est coloré. La coloration usuelle associe un colorant basique nucléaire (hématéine, hématoxyline) et un colorant acide cytoplasmique (éosine, érythrosine, ou phloxine). On y ajoute souvent du safran qui se fixe sur le collagène (figure 01.12). La coupe colorée est protégée par une lamelle de verre collée, ou par un film plastique transparent (figure 01.13). Elle est alors prête à être analysée au microscope par un médecin anatomopathologiste.
Techniques particulières
Examen histologique extemporané
Il s'agit d'un examen anatomopathologique pratiqué dès que le prélèvement est effectué, non fixé, pendant une intervention chirurgicale, afin de fournir rapidement au chirurgien un diagnostic susceptible de modifier le déroulement de l'acte chirurgical.
Les motifs les plus fréquents de demandes d'examens histologiques extemporanés sont :
• déterminer la nature inflammatoire ou tumorale d'une lésion et, en cas de tumeur, sa nature bénigne ou cancéreuse pour déterminer l'importance du geste d'exérèse chirurgical ;
• s'assurer qu'une biopsie chirurgicale a bien intéressé un territoire lésionnel représentatif de la maladie ;
• s'assurer que des limites de résection sont saines.
La technique utilise la macroscopie et, le plus souvent, des coupes congelées coupées au cryomicrotome (cryostat) et une coloration rapide, ce qui permet un résultat en moins de 30 min (figure 01.14). Une technique cytologique est parfois privilégiée, par exemple lorsque la lésion est de petite taille.
Cependant au cours d'un examen extemporané, la morphologie tissulaire n'est pas d'aussi bonne qualité qu'après une fixation et inclusion en paraffine, en raison de la congélation qui altère la morphologie cellulaire. En outre, pour respecter un délai de réponse court, il n'est pas possible d'examiner en totalité une lésion volumineuse. Le diagnostic fourni par un examen extemporané n'est donc pas aussi fiable qu'un diagnostic histologique conventionnel : il ne doit être considéré que comme un diagnostic de présomption. Il doit toujours être confirmé par l'examen du tissu restant après fixation et inclusion en paraffine. Il peut y avoir des discordances entre les diagnostics extemporanés et définitifs.
Les tissus calcifiés ne peuvent être coupés dans un cryostat et ne peuvent donc pas faire l'objet d'un examen histologique extemporané.
Colorations histochimiques spéciales
Des colorations spéciales ont pour but de mettre en évidence des constituants particuliers des cellules (glycogène, mucus, pigments, etc.), ou de la matrice extracellulaire (collagènes, fibres élastiques, amylose, etc.), ainsi que des agents infectieux (bactéries, parasites, champignons). Les colorations spéciales les plus fréquemment utilisées sont le PAS (pour identifier le glycogène, le mucus, les champignons), le rouge congo (pour identifier l'amylose), le perls (pour identifier l'hémosidérine), le Grocott (pour identifier les champignons).
Histoenzymologie
Certains enzymes peuvent être mis en évidence sur des coupes congelées ou parfois après inclusion dans la paraffine. La coupe est incubée dans un substrat spécifique de l'activité enzymatique recherchée. La réaction libère un produit coloré, ou colorable, qui peut être visualisé au microscope optique. L'application la plus courante est l'étude des biopsies musculaires pour myopathies.
Immunohistochimie
L'immunohistochimie consiste à mettre en évidence divers antigènes (Ag) cellulaires, ou extracellulaires, grâce à des anticorps (Ac) spécifiquement dirigés contre eux, sur des préparations cytologiques (immunocytochimie), ou sur des coupes de tissus congelés, ou fixés, et inclus en paraffine. Les Ag recherchés peuvent être des Ag membranaires, cytoplasmiques ou nucléaires, ou des protéines de la matrice extracellulaire. Si l'antigène recherché est présent dans le prélèvement, il est reconnu par l'Ac (appliqué sur la coupe dans une solution aqueuse) et le complexe Ag-Ac est visualisé au microscope par un fluorochrome ou un complexe enzymatique coloré.
L'immunofluorescence directe est surtout utilisée pour mettre en évidence les dépôts tissulaires d'immunoglobulines et de complément dans les biopsies cutanées et dans les biopsies rénales congelées, observées grâce à un microscope à fluorescence (figure 01.15).
Dans les méthodes immunoenzymatiques indirectes, l'Ac spécifique primaire est déposé sur le tissu, puis il est révélé par un 2e Ac couplé à une enzyme à laquelle on fournit son substrat. Le produit coloré de la réaction enzymatique apparaît au niveau du site des complexes Ag-Ac (figure 01.16). Cette réaction colorée permet un examen avec un microscope conventionnel (en lumière blanche).
L'immunohistochimie est très largement utilisée avec de multiples indications parmi lesquelles :
• intérêt diagnostique : classification précise de nombreuses tumeurs par la mise en évidence d'antigènes de différenciation cellulaire ou identification de certains agents infectieux ;
• intérêt pronostique : mise en évidence de protéines impliquées dans la prolifération cellulaire, ou de produits d'oncogènes ;
• intérêt thérapeutique : mise en évidence de cibles thérapeutiques, telles que les récepteurs nucléaires aux estrogènes et la protéine Her2 dans les cancers du sein.
Techniques de biologie moléculaire in situ
Ces techniques reposent sur la mise en évidence sur des coupes tissulaires (en congélation, ou après inclusion dans la paraffine), ou sur des étalements cellulaires, de séquences d'ARN ou d'ADN grâce à des sondes d'acides nucléiques complémentaires couplées à un traceur radioactif (sondes chaudes), ou à une enzyme (sondes froides), ou un fluorochrome (sondes fluorescentes). Le terme in situ indique que la détection s'effectue au sein des cellules en configuration native, visualisables au microscope, à la différence des techniques d'étude d'acides nucléiques qui sont réalisées sur un broyat du tissu ne permettant plus une analyse séparée des différents types cellulaires.
L'hybridation in situ classique a relativement peu d'indications car un grand nombre de copies de l'acide nucléique recherché doit être présent dans la cellule pour qu'une réaction visible soit obtenue. Elle peut être utilisée pour mettre en évidence des acides nucléiques viraux (HPV, EBV), ou des ARN de chaînes légères d'immunoglobulines.
L'hybridation in situ fluorescente (FISH) ou l'hybridation in situ chromogénique (CISH) peuvent se faire sur des suspensions cellulaires, des empreintes, ou des coupes congelées ou déparaffinées, et permettent d'identifier dans chaque cellule la présence et le nombre de copies d'un segment chromosomique donné et, en utilisant des fluorochromes différents, d'apprécier une éventuelle co-localisation. Elles sont de plus en plus utilisées pour rechercher des anomalies chromosomiques variées (polysomies, monosomies), ou géniques (délétions ou amplifications de certains gènes, translocations), anomalies qui peuvent avoir dans certaines tumeurs une valeur diagnostique ou pronostique.
Techniques de pathologie moléculaire
L'analyse morphologique des prélèvements cellulaires et tissulaires peut être complétée par une analyse moléculaire des constituants extraits des tissus : recherche de clonalité, de perte d'hétérozygotie, détection de mutations, de réarrangements, etc.. Ces techniques sont réalisées soit au sein des laboratoires de pathologie, soit au sein de plateformes de biologie moléculaire en relation étroite avec des pathologistes. Toutes ces analyses (sur cellules isolées, tissu frais, congelé ou fixé) doivent impérativement être effectuées après un contrôle morphologique du prélèvement analysé. Si le prélèvement est très hétérogène, ou si les cellules pathologiques sont rares, il est parfois nécessaire de le microdisséquer. Pour un patient donné, les résultats de ces techniques vont participer à l'établissement du diagnostic, à l'évaluation du pronostic ou permettre de guider les décisions de prise en charge thérapeutique.
Pathologie numérique
La pathologie numérique permet de remplacer la lecture d'une lame en verre au microscope par un examen de la même image numérisée (lame virtuelle) à partir d'un ordinateur personnel, utilisé en lieu et place du microscope ou à distance grâce à une connexion internet.
Résultats : le compte-rendu anatomopathologique
Les résultats de l'analyse anatomopathologique sont donnés sous la forme d'un compte-rendu écrit, dans lequel les lésions sont décrites, puis interprétées, avec le cas échéant une description des méthodes complémentaires utilisées, pour aboutir à une conclusion synthétique : diagnostic lésionnel ou hypothèses de diagnostic en fonction des renseignements fournis et des lésions observées. Chaque fois que cela est nécessaire (en particulier pour des tumeurs) des éléments de pronostic doivent être fournis. L'usage de terminologies et classifications nationales et internationales est recommandé. Le diagnostic morphologique doit toujours être confronté avec la clinique et, le cas échéant, la biologie et l'imagerie.
Le délai de réponse nécessaire, en raison des diverses contraintes techniques, est généralement de l'ordre de 48 heures au minimum. En cas de délai prolongé (examen en attente de techniques complémentaires ou demande d'avis auprès d'un expert), un compte-rendu provisoire peut être adressé, mais une décision thérapeutique ne peut s'appuyer que sur le compte-rendu définitif.
Déontologie et aspects législatifs
Le compte-rendu anatomocytopathologique est daté et signé par le médecin habilité qui a effectué l'examen et est adressé au médecin prescripteur de l'examen, éventuellement aux autres médecins en charge du patient. Le compte-rendu devient un élément du dossier médical du patient et est couvert par le secret médical. Les communications de comptes-rendus par télécopie ou par réseau informatique ne peuvent être utilisées que dans le cadre d'une procédure garantissant ce secret.
L'avis d'autres médecins anatomopathologistes peut être sollicité dans diverses circonstances : cas de diagnostic difficile, désaccord sur le diagnostic entre le pathologiste et le clinicien, avis d'un autre pathologiste sollicité à la demande du clinicien ou du patient. Cela nécessite l'envoi de lames, de blocs ou d'images numériques. Le pathologiste consulté rédige un compte-rendu écrit qui est adressé au pathologiste initial et est transmis au médecin en charge du patient.
Les résidus de pièces opératoires ou de prélèvements nécropsiques sont détruits après l'analyse anatomopathologique mais les blocs d'inclusion, les lames colorées et les comptes-rendus sont conservés par le laboratoire dans des archives : il s'agit d'une obligation légale. Après des années, il est donc toujours possible de réexaminer des lames ou de confectionner de nouvelles lames à partir du bloc d'inclusion tant que le matériel tissulaire n'est pas épuisé par les coupes successives.
Place de l'anatomopathologie dans la prise en charge pluridisciplinaire du patient
Des réunions de concertation pluridisciplinaire régulières organisées entre cliniciens, radiologues, chirurgiens, biologistes et pathologistes permettent de confronter le diagnostic morphologique aux données cliniques, d'imagerie, ou de biologie moléculaire. Elles peuvent être formalisées au sein de réseaux cliniques ville hôpital, pour la prise en charge de pathologies ciblées, ou en cancérologie. Seule une mise en commun des données permet d'assurer au patient un diagnostic fiable, une prise en charge de qualité (recherche de facteurs influençant le pronostic) et de proposer une stratégie thérapeutique.
Assurance qualité
La nécessité d'actualiser ses connaissances (formation continue) et la démarche d'assurance qualité s'imposent à tout médecin, au travers des articles 32 et 72 du Code de déontologie et de dispositions réglementaires.
Place de l'anatomie pathologique dans la recherche
L'anatomie pathologique continue à enrichir la sémiologie morphologique grâce à de nouvelles méthodes diagnostiques pour établir ou réviser les arbres décisionnels et comprendre la physiopathologie des maladies.
Cryopréservation des tissus
La congélation d'échantillons est habituellement faite dans un but diagnostique (immédiat ou principe de précaution pour donner au patient une chance supplémentaire, fonction de l'évolution des connaissances), mais aussi pour la recherche et/ou la constitution d'une collection (tissuthèques, tumorothèques, centres de ressources biologiques).
La conservation des prélèvements cryopréservés nécessite une infrastructure lourde, garantissant en particulier la rapidité de congélation, le contrôle de la qualité des prélèvements congelés, et leur conservation dans des conditions satisfaisantes. L'utilisation de ces collections nécessite la conformité aux règles éthiques selon la loi (information du patient, gestion du consentement), aux procédures d'assurance qualité et à la transparence des règles d'organisation, de fonctionnement et d'utilisation des prélèvements conservés. Les échantillons cellulaires ou tissulaires, cryopréservés ou non, ne peuvent être utilisés ou utilisables que s'ils sont associés à des informations cliniques sur le malade, des informations morphologiques concernant le diagnostic porté sur le prélèvement et des informations sur les échantillons (nature, quantité, conditions de collecte, de préparation, de conservation et d'utilisation). Ces prélèvements sont intéressants car la congélation rapide conserve l'intégrité de toutes les molécules et permet de réaliser la quasi-totalité des techniques de recherche. Cependant, le fragment congelé (en général de l'ordre de 5 mm de diamètre) représente une toute petite partie d'une lésion et est prélevé « à l'aveugle ». Par exemple dans une tumeur hétérogène, la congélation a pu être réalisée dans une zone peu agressive alors que la portion agressive intéressant le chercheur n'est disponible que sous forme fixée et incluse en paraffine.
Techniques d'analyse en recherche
Il existe de nombreuses techniques spécialisées, brièvement évoquées et de façon non exhaustive dans ce chapitre, certaines pouvant avoir des applications dans le diagnostic de routine (microscopie électronique, cytométrie en flux, morphométrie).
Épidémiologie, les registres
Par l'utilisation du codage systématique des lésions, les bases de données anatomopathologiques (système informatisé de gestion de laboratoire) constituent une base fiable, facilement exploitable pour l'épidémiologie (fréquence, prévalence des maladies). Ces données ne peuvent être exploitées que de manière anonyme et en accord avec la CNIL. Les pathologistes sont souvent sollicités pour participer à des enquêtes à l'échelon national (institut de veille sanitaire) sur une pathologie donnée.
• L'anatomie et cytologie pathologiques (ou pathologie) est une discipline médicale qui étudie les lésions provoquées par les maladies sur les organes, tissus ou cellules en étudiant la morphologie macroscopique et microscopique ainsi que les caractéristiques moléculaires des lésions. Une lésion élémentaire correspond à l'altération morphologique d'une structure analysée isolément. L'association de différentes lésions élémentaires constitue un ensemble lésionnel. Les lésions sont confrontées aux données cliniques, biologiques et d'imagerie : c'est la corrélation anatomoclinique, qui est indispensable pour permettre une interprétation synthétique et aboutir à un diagnostic. Le rôle du pathologiste est de contribuer à élaborer le diagnostic, à préciser le pronostic et à évaluer l'effet des thérapeutiques. Les résultats de l'analyse anatomopathologique sont donnés sous la forme d'un compte-rendu écrit, dans lequel les lésions sont décrites, puis interprétées pour aboutir à une conclusion synthétique : diagnostic lésionnel ou hypothèses de diagnostic en fonction des renseignements fournis et des lésions observées. Chaque fois que cela est nécessaire (en particulier pour des tumeurs) des éléments de pronostic doivent être fournis. L'usage de terminologies et classifications nationales et internationales est recommandé.
• Il existe différents types de prélèvements cytologiques : le recueil d'un liquide spontanément émis (ex. : urine, liquide de drain, expectoration) ; le raclage, brossage, écouvillonnage ou aspiration de cellules desquamant spontanément (ex : frottis de col utérin, aspiration après lavage bronchoalvéolaire) ; la ponction à l'aiguille d'un liquide (ex. : ponction de liquide pleural, ponction lombaire) ; la ponction à l'aiguille d'un organe ou d'une tumeur (ex. : cytoponction dirigée sur un nodule thyroïdien) ; l'apposition d'un tissu sur une lame (ex. : apposition d'un tissu ganglionnaire).
• Il existe différents types de prélèvements tissulaires : une ponction-biopsie d'un organe plein qui permet l'analyse d'une carotte tissulaire (ex. : ponction-biopsie de foie, de rein) ; une biopsie chirurgicale (ex : biopsie hépatique lors d'une laparotomie, biopsie exérèse d'un ganglion lymphatique) ; une biopsie à la pince réalisée au cours d'une endoscopie (ex. : biopsie bronchique, biopsie gastrique) ; une pièce de résection partielle ou complète d'un ou plusieurs organes (ex. : segmentectomie hépatique, prostatectomie, cholécystectomie, duodénopancréatectomie céphalique) ; les prélèvements réalisés au cours d'une autopsie.
• Différentes étapes techniques sont un préalable à l'analyse microscopique d'un prélèvement cellulaire :
recueil des cellules sur une ou plusieurs lames de verre (étalement réalisé sur le lieu du prélèvement ou cytocentrifugation d'un liquide réalisée au laboratoire ou technique monocouche),
fixation par séchage rapide à l'air ou par utilisation d'un fixateur chimique,
coloration des cellules.
• Différentes étapes techniques successives sont un préalable à l'analyse microscopique d'un prélèvement tissulaire :
fixation tissulaire indispensable pour conserver la morphologie tissulaire, devant être débutée très rapidement après l'obtention du prélèvement, le plus souvent par utilisation de formol tamponné à 4 %,
macroscopie pour documenter les lésions macroscopiques et faire le choix des prélèvements destinés à l'analyse microscopique,
imprégnation et l'inclusion en paraffine,
coupe au microtome,
coloration des tissus.
• La qualité des prélèvements conditionne la qualité de l'étude anatomopathologique. Le médecin préleveur et prescripteur a une responsabilité dans l'acte anatomopathologique en s'assurant de la bonne réalisation technique du prélèvement et de son acheminement dans de bonnes conditions au laboratoire.
• La fixation est indispensable pour conserver la morphologie cellulaire, elle doit être immédiate ou au moins très rapidement débutée après l'obtention du prélèvement. Toute fixation défectueuse rend l'étude anatomopathologique difficile, voire impossible (dessiccation et/ou autolyse du tissu).
• L'examen cytopathologique est le plus souvent un examen de dépistage ou d'orientation diagnostique. Un contrôle par biopsie peut être nécessaire. Cet examen cytopathologique permet d'analyser les caractéristiques cytoplasmiques et nucléaires des cellules isolées de leur contexte tissulaire. Les anomalies observées dans des cellules cancéreuses peuvent être difficiles à distinguer de modifications cellulaires induites par des phénomènes inflammatoires.
• L'examen extemporané correspond à un examen anatomopathologique pratiqué dès que le prélèvement est effectué, non fixé, pendant une intervention chirurgicale, afin de fournir rapidement au chirurgien un diagnostic susceptible de modifier le déroulement de l'acte chirurgical. Au cours d'un examen extemporané, la morphologie tissulaire n'est pas d'aussi bonne qualité qu'après une fixation et inclusion en paraffine, en raison de la congélation qui altère la morphologie cellulaire. En outre, pour respecter un délai de réponse court, il n'est pas possible d'examiner en totalité une lésion volumineuse. Le diagnostic fourni par un examen extemporané n'est donc pas aussi fiable qu'un diagnostic histologique conventionnel : il ne doit être considéré que comme un diagnostic de présomption.